梯度優化是液相色譜方法開發中非常重要的一個環節，有時一個合適的梯度洗脫程序對液相色譜分析分離起到四兩撥千斤的作用。
一、建立梯度方法的原因
為什么要用梯度的方式來洗脫呢？混合樣品組分中，必定存在容易分離和不易分離的組分，保留較弱和保留較強的組分。我們建立梯度洗脫程序的目的就在于，將容易分離的組分在洗脫能力較弱的流動相中實現盡快分離，而保留較強的組分在色譜柱內停留較長時間，與鍵合相表面發生充分的相互作用，盡可能地彼此拉開，最后用強洗脫能力的流動相洗脫出來，避免洗脫時間過長。
二、反相液相色譜體系流動相的洗脫能力
反相色譜中如何判斷流動相的洗脫能力呢？在反相體系中，隨著流動相的極性不斷增加（水相的比例在不斷增加），流動相整體的洗脫能力逐漸減弱，而保留時間則在逐漸延長。因此對于容易分離的組分，可嘗試在流動相極性較大的環境下將其實現分離。
同時，為了提高整個樣品混合組分的分離度，在整個梯度程序內，也盡可能使用高比例的水相作為梯度洗脫的起始條件。因此進行一個全新項目的反相條件方法開發的時候，最常用的初始梯度模式便是在0~40min內，進行一個95%水相有機相的線性洗脫。
三、反相液相色譜梯度優化中心思路
反相色譜梯度優化的中心思路，其實就是盡可能減弱流動相的洗脫能力，從而減少共洗脫的情況。減弱流動相洗脫能力最有效的方式是更換洗脫強度弱一些的溶劑，或者增減流動相中的添加劑。
然而很多情況下是參照既定標準進行實驗，溶劑種類和添加劑的量不便進行過多的調整，這樣的情況下，還有一個方法可以調節流動相的洗脫強度，那就是減緩流動相的變化斜率。
在進行方法開發梯度優化的時候，一定要注意兼容性的問題，包括流動相溶劑彼此之間的兼容性，以及流動相和樣品的兼容性。流動相溶劑選擇上，選擇能夠任意比例互溶的溶劑。若是流動相溶劑不方便更換，則需盡量減緩流動相的變化速率，給有機相和水相（鹽相）更多的時間來互溶。對于樣品來說，流動相的性質一定要注意與樣品溶劑能夠兼容，避免出現在進樣后的任意時刻樣品不溶解、析出的情況。
（內容參考儀器信息網）
