1.要根據國家標準和有關的規定，向所有可能使用生物安全柜的用戶解釋安全柜的使用及限制條件。應發給工作人員書面規定或安全手冊或操作手冊。特別是必須明確告訴工作人員，在出現濺灑、破碎、方法不當的情況下，安全柜無法保護操作人員。
2.安全柜只有在工作正常時才能使用。
3.安全柜前臉的玻璃觀察窗不得在安全柜處使用狀態時打開。
4.柜內放置的儀器和材料必須保持在最低數量。靜壓箱后部的空氣循環不得受阻。將材料放入安全柜的工作區之前，應對其表面進行去污處理。
5.柜內不得使用本生燈(一種煤氣燈)，因其產生的熱會干擾氣流并可能損壞過濾器。可以使用微型電焚燒爐，但使用一次性滅菌環則更好。
6.柜內所有的工作要在工作面的中部或后部進行，并能從觀察面板中看到。
7.操作手后方的活動要達到最少。
8.操作手不應將手臂來回伸進出柜子，以免干擾氣流。
9.前送風格柵不得被便簽、滴管、或其他材料堵住，否則會干擾氣流從而可能使材料受到污染，使人員處在暴露狀態。
10.應在每次工作完成后及一天結束時，使用合適的消毒劑清潔安全柜的表面。
11.柜子的風扇在工作開始前和工作完成后要再各運行5分鐘。
生物安全柜安放位置
從生物安全柜前臉的開口流入柜內的氣流速度約為0.45米/秒。以這一風速，柜內單向流的一致性易受干擾，很容易被安全柜附近人員的走動、開窗、送風配風器、門的開關所干擾。按理想的布置，應放在遠離活動及可能有干擾氣流的地方。應盡量在安全柜的后側及兩側留下30厘米的空間，便于維護作業。柜子上方則留下30~35厘米的高度，以便對排風過濾器的風速進行精確測量，并為排風過濾器的更換留下足夠空間。
生物安全柜的清潔與消毒
生物安全柜內的所有物品，包括設備，都應在工作完成之后進行表面去污處理并從柜內取出，因為殘留的培養介質可能會提供微生物的生長條件。安全柜的內表面應在每次使用前與使用后進行去污處理。要用消毒劑擦拭工作臺表面及內壁面，使用的消毒劑應能殺死柜內可能存在的所有微生物。一天工作結束時，應進行最后表面去污處理，即對工作臺、各個側面、背面及玻璃的里面進行全面擦拭。可以使用漂白粉液或70%酒精，這種對目標生物有效的消毒劑。如使用漂白粉液這種有腐蝕性的消毒劑，則要用滅菌水進行二次擦拭。建議工作柜在清潔、消毒時處在工作狀態。如果其未處在工作狀態，則應運行5分鐘，以便在安全柜關閉前將其中的氣體清除掉。
生物安全柜的去污處理
對1級和2級生物安全柜的去污，是將適量的低聚甲醛(使柜內空氣中的低聚甲醛的最終濃度為80%)置于電熱盤或煎鍋上(從柜外控制)。另將一個放有比低聚甲醛多10%的碳酸氫的電熱盤或煎鍋也放在柜內(在柜外控制)。這第二個容器上應帶蓋，這個蓋子可以從遠處取下來(例如系在一根線上，線可以從柜外拉動)。這樣可以使提前中和的低聚甲醛達到最小。如果相對溫度低于70%，有熱水的開口容器。如果沒有前隔板，則要用生型塑料擋板，將其用膠帶粘在前臉，確保不會有氣體漏入房間。當盤內的低聚甲醛已全部揮發或開關已打開1小時后，將開關關閉。將安全柜放置一整晚不得觸動。然后將第二個盤子的蓋移開并打開其開關，碳酸氫氨開始揮發。這時，關閉盤子的開關，讓安全柜開始工作，使碳酸氫氨氣循環1小時。然后可以取下前隔板(或塑料擋板)，安全柜即可使用。
