一、概述
高效液相色譜方法的開發過程中，一個總的原則是：先找到目標化合物的峰，然后調整峰形，再是進一步完善。本文主要介紹調整峰形中峰形后拖的解決方案。
二、峰形后拖常見形式及原因
在這里撇開所有的污染、塌陷、死體積等其它因素，假設系統是好的，柱子是新的、好的，單純探討液相方法與峰形后拖之間的關系，通過調整液相方法來解決峰形前拖的問題。這樣有利于厘清拖尾產生的根本原因，對峰形拖尾的問題提供一些經驗上解決方案。
系統是好的，柱子是好的，為什么會產生后拖？我們還是回顧一下，色譜分離的一般過程，正常的峰形應該是樣品在色譜柱上均勻前移的情況下得到的，濃度分布在整個通過色譜柱柱床的過程中任何時候都呈正態分布。
色譜分離是一個物理過程，樣品分子經過在固定相與流動相之間的多次分配、吸附解吸，由于不同分子與固定相和流動相之間的相互作用力的差異而使它們在色譜柱中的移動速度不同，以此實現分離的目的。相同色譜條件下，有些化合物容易產生拖尾，有些則不產生拖尾，這說明拖尾的產生跟樣品本身的性質是密切相關的，通常非極性和弱極性的化合物能獲得良好的峰形，而帶有－COOH、－NH2、－NHR、－NR2等極性基團的化合物則比較容易產生拖尾。
可以想象一下，樣品分子在分析過程所處的環境，一是流動相，二是固定相，流動相可以自由流動的，均一性比較好，因此可以認為樣品分子四周都被相同組成的流動相所包圍，其對每個樣品分子的相互作用力也是均勻的、對稱的，不應該是引起濃度分布發生變化的主要原因。考慮固定相，固定相中除了C18長鏈外還有填料鍵合時殘余的硅羥基，由于C18長鏈是非極性的，其與樣品分子的相互作用力也是很微弱的范德華力，而硅羥基則具有一定的極性Si－Oδ－Hδ＋，在pH一定的條件下甚至還會發生電離，形成－Si－O－ 形式的離子態。Si－Oδ－Hδ＋和－Si－O－對于極性化合物之間的作用力則是一種極性的靜電作用力，這種作用力比范德華力要強得多，同時，因為硅膠表面鍵合了C18長鏈，由于空間位阻作用，樣品分子中能接觸到殘余硅羥基的機會不會很多，只有少部分的分子才能與殘余硅羥基產生作用。這樣，大多數的樣品分子如非極性分子一樣均勻前移，而少量的樣品分子由于這種靜電作用力的存在而被推遲洗脫出來，導致樣品分子的濃度分布發生變化，產生后拖。拖尾嚴重的程度與樣品分子極性大小和殘余硅羥基的多少有著直接的關系。殘余硅羥基對樣品的次級保留效應是導致峰形后拖的主要原因。
三、峰形后拖解決方法
發現峰形后拖時，建議按下面的步驟逐步排除可能的原因，然后找到相應的對策，消除峰形后拖的狀況、改善峰形。
1、先檢查一下是否是樣品過載
樣品過載，通常會引起峰形變差，導致前拖、后拖或平頭峰，如果出現平頭峰、峰高超過2000mAU或峰很高的同時又前拖、后拖得很厲害通常都認為是過載的，但這一點也并不絕對，因為不同化合物的吸收強度不一樣，如果一種化合物在某一波長處有強吸收，即使出現了平頭峰，樣品也不一定過載，這與儀器和軟件有關；相反如果吸收弱，則高濃度條件下峰也不見得有多高；所以樣品是否過載應該結合濃度、進樣體積和峰形一起來判斷。通常認為峰高在100mAU左右比較合適，不至于因過載影響峰形。由于樣品過載引起的峰形后拖不容易消除，也可能根本無法消除，繼續采用以下的峰形改善措施可能不會有什么作用，而且在過載的情況下無法看清正常濃度時樣品真實的分離狀況和峰形，因此需要優先考慮是否過載，否則繼續往下調整峰形的努力將無任何意義。
如果發現過載，需降低進樣量（包括進樣體積或濃度），但不管怎么樣，減少進樣量通常對改善峰形總是有益的，一般而言，進樣量越小，峰形越好。
2、往流動相中加入酸
根據這一解釋，往流動相中加酸將流動相的pH調至2.5以下有助于改善峰形，這種方式，主要用于改善對帶羧基化合物的拖尾。
堿性化合物中，容易發生拖尾的化合物中通常包含著－NH2、－NHR、－NR2，即伯、仲、叔三種富電荷的極性基團，它們的堿性強弱順序為：－NH2 < －NHR < －NR2，其堿性強弱跟與N原子直接相連的基團有關，吸電子基團會削弱這種堿性，供電子基團（如烷基）則使之增強。伯氨中甲胺的堿性最弱，以它為例更具有代表性，甲胺的pKa為10.64，那么在pH<8.64的時候它是完全呈離子態的，也就是－NH3＋，那么pH在2.5~8.64時，特別是pH6.7～8.64時，因為此時帶氨基的化合物和硅羥基均以離子狀態－NH3＋和Si－O－形式存在的，它們之間相互吸引的靜電作用導致后拖，這就是為什么很多堿性化合物在pH 7.0的條件下容易產生拖尾的原因，而很多色譜柱生產商也因此以阿米替林（含－N(CH3)2，堿性比－NH2強）在pH 7.0的條件下來評價和比較不同色譜柱之間的優劣，該條件下的阿米替林的峰形越好說明封尾越好，封尾工藝成功的阻止了殘余硅羥基與樣品分子的接觸。而在pH<2.5的條件下，也仍然后拖，是因為－NH3＋足夠強，即使硅羥基以分子狀態存在也仍能夠與Si－Oδ－Hδ＋中氧原子產生吸引作用，導致峰形拖尾。當pH>12.64的時候，甲胺完全以分子狀態形式存在，不會引起拖尾。所以分析有些化合物，流動相的pH需要調至強堿性條件下峰形才會變好。
3、增加緩沖鹽或增大緩沖鹽的濃度
流動相中加入緩沖鹽，增強了流動相的離子強度，在－NH3＋等極性基團和硅羥基Si－O－之間存在著許多離子的干擾，減少了樣品分子與硅羥基之間相互接觸的機會，有助于削弱極性基團與硅羥基之間的相互作用，改善峰形。這種適合于堿性較弱（如氨基的N原子與強吸電子基相連），或堿性很強，但在剛性結構中，比較難以接近被C18長鏈和封尾試劑覆蓋的硅羥基。
4、往流動相中加入三乙胺、四丁基硫酸氫銨或辛烷磺酸鈉等
基于上面的解釋，既然拖尾的產生是因為－NH2、－NHR、－NR2與硅羥基發生靜電作用引起的，那么阻礙它們之間靜電作用的途徑，應該有兩種，一種是占據硅羥基這個作用位點，另一種是占據－NH2、－NHR、－NR2這個作用位點。
1）流動相中加入三乙胺
在流動相中加入三乙胺，能顯著的改善峰形，消除拖尾。其作用是屏蔽硅羥基，使堿性化合物在分離的過程中減少了和硅羥基相互接觸的機會，失去了導致拖尾的作用位點。三乙胺的pKa為11.09，在pH<11.09－2＝9.09的條件下是以離子狀態N＋H(CH2CH3)3的形式存在的，因此pH在2.5~8.64 硅羥基呈Si－O－離子態的情況下，N＋H(CH2CH3)3容易與Si－O－形成相對較強的靜電吸引力，流動相中加入了三乙胺后，平衡柱子的過程中已經優先占據了硅羥基的作用位點，而帶氨基的樣品分子雖然在該pH條件下也呈離子狀態－N＋H3、－N＋H2R或－N＋HR2 ，也能與Si－O－形成相對較強的靜電吸引力，但三乙胺有先占住位點的優勢，使樣品分子與硅羥基的作用大大減弱，緩解了拖尾的產生；同時，流動相中存在的N＋H(CH2CH3)3仍然與樣品分子中的極性基團與硅羥基的相互作用產生競爭，更進一步的削弱了樣品分子與硅羥基的接觸機會，改善峰形。
通常加入三乙胺的量約為2％即有顯著的效果，如有需要可適當增大用量。加入三乙胺改善峰形的時候，有兩點需要注意的：1）三乙胺的堿性很強，加入三乙胺后流動相的pH可能超出色譜柱的使用范圍，對色譜柱造成損傷，同時，pH的改變也會導致出峰時間的顯著變化，為了避免保留時間變化太大而可能引起的其它問題，因此，建議流動相中加入三乙胺后回調至未加入前的pH值，但通常即使pH回調過也仍會引起保留時間的較大變化；2）三乙胺在210nm處有比較強的吸收，如果液相方法中檢測波長在210nm以下測定時需要謹慎使用，以免因加入三乙胺后本底上升，而引起峰高、峰面積下降，檢測靈敏度嚴重降低，有些甚至看不到峰。所以三乙胺用于改善峰形，其使用范圍是有一定限制的。
2）流動相中加入四烷基季銨鹽等離子對試劑
由上可知，加入三乙胺能改善峰形是由于pH<9.09的條件下，三乙胺的狀態為N＋H(CH2CH3)3與硅羥基的離子態Si－O－形成相對較強的靜電吸引力，占據了位點，有效的阻止了氨基與硅羥基的接觸造成的次級保留效應。同樣，四烷基季銨鹽（如四丁基硫酸氫銨、四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨等）在水中電離后，也形成了類似N＋H(CH2CH3)3的結構N＋(CH2CH2CH2CH3)4，這種結構也能有效的與Si－O－產生較強的靜電作用，阻止氨基與硅羥基的接觸，改善峰形。而且它還有一個不同于三乙胺的顯著特點是，它在低波長范圍的吸收比三乙胺弱。
3）流動相中加入辛烷磺酸鈉等離子對試劑
流動相中加入辛烷磺酸鈉等烷基磺酸鹽離子對試劑也能很好的改善峰形，其作用機理與三乙胺和四丁基硫酸氫銨頗為不同。三乙胺和四丁基硫酸氫銨是通過與硅羥基的作用來阻止樣品分子中的氨基與硅羥基接觸，而烷基磺酸鹽則是通過與樣品分子的作用來阻止樣品分子與硅羥基的作用來改善峰形。以庚烷磺酸鈉為例，庚烷磺酸鈉在水中電離成SO3－CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3而樣品分子中的幾種結構的氨基則大約在pH<9的條件下形成呈離子狀態－N＋H3、－N＋H2R或－N＋HR2，顯然，SO3－CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3能與它們形成較強的靜電作用，有效的阻止了樣品分子與硅羥基的作用，改善峰形。
（內容來源儀器信息網）
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