苯甲酸、山梨酸、糖精鈉是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，苯甲酸、山梨酸的檢測參照GB/T5009.29-2003，糖精鈉的檢測參照GB/T5009.28-2003，即可開展實(shí)驗(yàn)。
苯甲酸、山梨酸、糖精鈉雖是較常見的檢測項(xiàng)目，但是要得到一個(gè)準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，也存在一定的難度，許多新手常出現(xiàn)因?qū)Ψ椒ɡ斫獍l(fā)生偏差而檢測出錯(cuò)的事故。
本文以苯甲酸、山梨酸為著重點(diǎn)，從樣品前處理、檢測儀器的選擇、超標(biāo)時(shí)的判斷等幾個(gè)易出問題的方面，進(jìn)行詳細(xì)的闡述，以供參考！
一、樣品前處理的注意事項(xiàng)
GB/T5009.28-2003和GB/T5009.29-2003在文字結(jié)構(gòu)上有缺陷，在涉及用儀器法測定苯甲酸、山梨酸、糖精鈉時(shí)，只講述了液體樣品的前處理方法，沒有涉及對固體樣品的前處理。
食品樣品往往含有大量的油脂、蛋白質(zhì)，對提取極為不利；如處理不干凈也會污染色譜柱，影響檢測工作。這類樣品處理的關(guān)鍵在于如何找到一種較理想的沉淀劑，盡量排除待測樣品中的油脂、蛋白質(zhì)，且不影響待測物組分的回收率。
GB/T5009.29-2003使用5％硫酸銅溶液沉淀蛋白，對于蛋白質(zhì)含量較低的食品尚可，對于豆粉、奶粉、月餅等高油脂、高蛋白樣品則沉淀效果不理想。如用10％鎢酸鈉溶液作為沉淀劑，效果好些；如用10％亞鐵氰化鉀溶液和20％醋酸鋅溶液則效果更理想（這是筆者目前用過最理想的沉淀劑）。
具體操作步驟如下：
取一定量樣品，搗碎，利用四分法原理稱取樣品5.0克于50ml比色管中，加水20ml，浸泡、振蕩均勻，加入氫氧化鈉溶液(1mol/L)1.0ml，加入9.5mL10%亞鐵氰化鉀溶液， 9.50mL 20%乙酸鋅溶液，定容，振蕩使其充分混勻后,用濾紙初濾除去沉淀物, 初濾液過0.45μm微孔濾膜,收集濾液于樣品瓶中，樣品處理液和標(biāo)準(zhǔn)有溶液各進(jìn)樣5uL測定。
用這種方法簡單易行，接觸有機(jī)試劑少，重復(fù)性和回收率都令人滿意；缺點(diǎn)是一定要用液相色譜法檢測，有一定局限。
二、檢測儀器的選擇
雖然液相色譜儀操作起來比氣相色譜儀要復(fù)雜，但建議如條件許可仍盡量用液相色譜法檢測。原因如下：
2.1 液相色譜法所用的樣品處理方法遠(yuǎn)比氣相色譜法簡單，且不需使用有機(jī)試劑。尤其對于高油脂樣品（如月餅）若采用堿化－排油－酸化－提取－揮干－溶解等步驟，再上氣相色譜儀檢測，工作量大，試劑毒性也大，且結(jié)果由于處理步驟太多而難以保證準(zhǔn)確。
2.2 用液相色譜法還可同時(shí)完成糖精鈉項(xiàng)目的檢測，而氣相色譜法只能做苯甲酸、山梨酸的檢測。
2.3 液相色譜儀所用的紫外檢測器比氣相色譜儀的氫火焰檢測器靈敏，可進(jìn)行更低含量的檢測。如用二極管陣列檢測器，還可輔助定性，這更是氣相色譜氫火焰檢測器不可比擬的。
三、選用氣相色譜儀時(shí)的注意事項(xiàng)
GB/T5009.29所用的氣相色譜柱為 5％DEGS＋1％磷酸固定液的60－80目 Chromosorb W AW，。這種柱有性能穩(wěn)定、重復(fù)性好、保留時(shí)間穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也有穩(wěn)定時(shí)間較長的缺點(diǎn)。
該柱的適用的樣品提取溶劑為石油醚或乙醚，如果用甲醇或乙醇，則溶劑峰拖尾效應(yīng)較大，對山梨酸的測定有影響。
如用毛細(xì)管柱，能取得更好的峰形和靈敏度，但其穩(wěn)定性及特異性不如填充柱。一般可用非極性毛細(xì)管柱，0.530mm內(nèi)徑，10－15m長度。色譜條件可能需用程序升溫。
在氣相色譜儀上的出峰次序?yàn)橄瘸錾嚼嫠幔蟪霰郊姿帷?/p>
糖精鈉不能直接用氣相色譜進(jìn)行檢測，必須衍生化后才能汽化進(jìn)樣。
四、選用液相色譜儀的注意事項(xiàng)
按照GB/T5009.29，流動(dòng)相應(yīng)為5：95的甲醇：0.02M醋酸銨溶液，但是這個(gè)比例僅是個(gè)參考值，我們在工作中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。
為什么用甲醇溶液？甲醇有兩個(gè)作用，（1）防腐，液相色譜柱最怕流動(dòng)相長菌，尤其霉菌。甲醇可使蛋白質(zhì)變性，有殺菌作用。（2）調(diào)節(jié)流動(dòng)相極性，這是最重要的一點(diǎn)。甲醇在溶液中比例的較小變化都會使苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的保留時(shí)間發(fā)生明顯的改變，因此可以通過改變流動(dòng)相中甲醇含量，以調(diào)節(jié)這幾個(gè)組分的出峰和分離，以得到較理想的色譜圖。
5：95是一個(gè)通用的比例，如減少甲醇含量，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的出峰時(shí)間變慢，擴(kuò)散效應(yīng)增大，峰形較差，但這三組分的分離情況較好。如增加甲醇含量，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的出峰時(shí)間提前，擴(kuò)散效應(yīng)較小，峰形尖銳，但這三組分的分離情況可能受影響，產(chǎn)生重疊。在選擇條件時(shí)，只能通過實(shí)驗(yàn)手段，如配制3：97，4：96，5：95，6：96，7：93的流動(dòng)相，綜合考慮分離效果和分離時(shí)間選擇最佳比例。
不同柱的最適比例不同，舉例來說，色譜科公司的液相柱最適比例為4：96，而島津公司液相柱的最佳比例為7：93。就是同一根柱，一年前和一年后的極性也會有變化，需調(diào)節(jié)溶液配比。
為什么使用0.02M醋酸銨溶液？加入醋酸銨是為了調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，使待測物的峰形不致于變壞。如果單獨(dú)檢測苯甲酸和糖精鈉，加不加醋酸銨沒有什么關(guān)系，都可以得到較好的峰形；但是檢測山梨酸時(shí)流動(dòng)相一定要加醋酸銨，否則得不到一個(gè)完整的色譜峰，峰形呈破裂狀。
酸銨溶液濃度不需嚴(yán)格控制，0.01M、0.02M、0.04M均可。
苯甲酸、山梨酸、糖精鈉在液相上的出峰次序很有特點(diǎn)。在流動(dòng)相5：95及以下比例時(shí)，次序是苯甲酸、山梨酸、糖精鈉（注意一下氣相的出峰次序），逐步增大甲醇含量，苯甲酸、山梨酸的出峰時(shí)間逐步提前，而糖精鈉是出峰時(shí)間迅速提前，隨著甲醇比例的逐步增大（15％－30％），原先在最后出峰的糖精鈉集次和前面的山梨酸、山梨酸重疊，并位于最前面，其次序變?yōu)樘蔷c、苯甲酸、山梨酸。再提高甲醇濃度，次序不變。
用高甲醇比例條件（甲醇15％以上）做出的三種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖峰形較好，出峰時(shí)間也較快，但做實(shí)際樣品時(shí)干擾較大；因此建議盡量使用低甲醇比例條件（甲醇5％左右）。
五、苯甲酸、山梨酸超標(biāo)時(shí)的判斷
苯甲酸、山梨酸超標(biāo)的樣品較多，由于它們往往牽涉到一批貨物是否合格，因此責(zé)任重大。由于該方法定量較準(zhǔn)確，因此遇到超標(biāo)樣品時(shí)應(yīng)將精力集中于定性方面。
如同時(shí)有氣相色譜儀和液相色譜儀，建議用這兩種性質(zhì)相差較大的儀器進(jìn)行對照，如定量結(jié)果差不多，即可確認(rèn)。
如只有氣相色譜儀，應(yīng)利用其在填充柱保留時(shí)間穩(wěn)定的特性，同時(shí)進(jìn)五針標(biāo)準(zhǔn)液和五針樣品液（注：峰面積應(yīng)差不多，否則需對一方按比例稀釋），如標(biāo)準(zhǔn)和樣品液的保留時(shí)間相差時(shí)間超過1 秒，可認(rèn)為不是。（如進(jìn)針的技術(shù)不過關(guān)，請不要做此實(shí)驗(yàn)）
如用液相色譜儀，當(dāng)檢測器為二極管陣列檢測器時(shí)，根據(jù)保留時(shí)間和紫外吸收圖結(jié)合性，
當(dāng)只有紫外檢測器時(shí)，改檢測波長為220nm，230nm，250nm，重復(fù)進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)和樣品液，由標(biāo)準(zhǔn)和樣品在不同波長的峰高比值看是否吻合。
如有微生物檢測手段，可加樣品于有菌培養(yǎng)基中，觀察有無抑菌現(xiàn)象，如無抑菌現(xiàn)象則無防腐劑。
不是很推薦用雙柱法，因?yàn)橛袝r(shí)柱極性相差不大，反而會影響最終判斷。
六、糖精鈉超標(biāo)時(shí)的判斷
當(dāng)檢測糖精鈉超標(biāo)時(shí)，除了采用二極管陣列檢測器或波長驗(yàn)證，還可以利用糖精鈉的熒光特性，用熒光檢測器進(jìn)行驗(yàn)證。熒光條件是激發(fā)波長為277nm，熒光波長為410nm。只有當(dāng)用熒光檢測器和用紫外檢測器做出的定量結(jié)果相差不多，才可以判斷為是。
還有一個(gè)簡單粗糙、卻也行之有效的驗(yàn)證方法，即感官法。糖精鈉是一種甜味劑，用舌頭可以感覺到它的甜味，如果含量超標(biāo)，一定能嘗出來。
七、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制貯存問題
苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的標(biāo)準(zhǔn)溶液如用水、乙醇作基體，一般幾個(gè)月后會嚴(yán)重降解，。如用甲醇溶解再放于冰箱冷凍層，可保持穩(wěn)定一兩年。因此推薦用甲醇作溶劑。
在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，初學(xué)者常犯的錯(cuò)誤多為用甲醇溶解苯甲酸鈉，用水溶解苯甲酸，晃了半天才發(fā)現(xiàn)怎么也不沒溶解。應(yīng)該用弱堿性水溶解苯甲酸鈉、山梨酸鉀，用甲醇溶解苯甲酸、山梨酸。
八、苯甲酸、山梨酸的應(yīng)用范圍
首先應(yīng)注意到，并不是所有食品都需要加入防腐劑，只有那些富含營養(yǎng)物質(zhì)，且需要長時(shí)間暴露于空氣的才有這樣的需要，否則對廠家來說會增加不必要的成本。
醬油、醬料、咸菜、濃縮果汁等由于開封后不可能短期內(nèi)吃完，月餅等需在貨架上擺放，如不加防腐劑很快會發(fā)霉變質(zhì)，有添加防腐劑的必要。而利樂裝或易拉罐裝的飲料由于很快可以食用完畢，即在細(xì)菌大量繁殖前己被消化了，因而沒有添加的必要。
苯甲酸、山梨酸如果要起到防腐的作用，含量就不能太低。如果我們檢測樣品時(shí)只有幾個(gè)ppm的濃度，有可能是從原料中帶來的或由其它添加劑轉(zhuǎn)化來的，而不是廠家出于防腐目的加入的。
苯甲酸、山梨酸也只是防腐劑中的兩種。并不是所有需要加入防腐劑的食品都會添加苯甲酸、山梨酸，有可能使用防霉劑或其它種類的防腐劑，或自行規(guī)定需冷藏（如某些月餅）。因此有些食品檢測不出也屬正常。
另外，我們應(yīng)該比較清楚地理解苯甲酸與苯甲酸鈉、山梨酸與山梨酸鉀之間的關(guān)系。在食品中添加防腐劑通常以苯甲酸鈉、山梨酸鉀形式加入，它們不易汽化，易溶于水，但不溶于甲醇等有機(jī)試劑；而苯甲酸、山梨酸易汽化，易溶于有機(jī)試劑，但是幾乎不溶于水。檢測時(shí)要注意有機(jī)酸及其鹽類之間的轉(zhuǎn)換。
（內(nèi)容來源液相色譜之家）
