色譜儀柱效下降的表現一般是峰變寬和峰高下降，有的時候會出現分叉峰。造成柱效下降的原因很多，很多時候我們會想到柱子的問題，其實溶劑與流動相的不匹配會造成柱效下降。本文主要說明溶劑造成柱效下降和峰分叉的原因。
一、實驗
儀器：高效液相色譜儀配自動進樣器，UV/vis檢測器；C18色譜柱，4.6×250mm，5μm。
試劑：分析物F（易溶于甲醇和冰醋酸，微溶于乙醇和水，進樣用80%的甲醇溶解），磷酸二氫鈉（分析純），乙睛（色譜純），甲醇（分析純）。
檢測條件：檢測波長214nm，緩沖溶液0.01M磷酸二氫鈉緩沖溶液；流動相：乙腈：緩沖鹽=15:85。進樣體積：100μl。
如圖1，在緩沖溶液pH =5.0時出現分叉峰（圖1），樣品F濃度為2μg/ml。下調緩沖鹽pH =3.0，仍然出現分叉峰（圖2）。
圖1. pH=5.0色譜圖
圖2. pH=3.0色譜圖
同時我們發現所有的雜質峰也都出現了分叉情況（圖3）。
圖3. 雜質峰也出現分叉
二、原因分析
是什么原因造成了這種現象呢？
首先想到的是大體積進樣造成的（因為進樣20μl不能檢測到所分析物質F濃度）進樣100μl一般會造成峰擴展，柱效下降，如果降低進樣量還會出現分叉峰嗎？實驗結果如圖4。進樣體積減小，峰分叉的情況逐漸改善，在進樣50μl的情況下，形成了肩峰（圖4小圖），進樣40μl肩峰消失。
圖4 依次進樣20,40,50,80,100μl的色譜圖。小圖為50μl進樣后積分，該圖顯示色譜峰有肩峰
一般來說，加大進樣體積，峰會展寬很多，分離度降低，柱效下降（極端情況下如果是微柱或者UPLC會看不到峰），不會出現峰分叉，分叉峰是怎么形成的呢？更奇怪的是進樣體積越大，出峰時間越靠前，在進樣100μl和進樣20μl的情況下，出峰時間相差4分鐘，為什么進樣體積會影響出峰時間？
造成這些現象的原因只有一個：溶解分析物F的溶劑，增加進樣體積只是放大了溶劑影響。在我們的實驗中，溶劑采用80%的甲醇溶解，而流動相是15%的乙腈，在反相色譜中，80%的甲醇洗脫能力強于15%的乙腈，就是說溶解F的溶劑極性小于流動相的極性。當樣品進入色譜后，一部分分析物質會和固定相結合，一部分還沒有和固定相結合就被洗脫能力強的溶劑帶著沿流動方向移動（色譜柱縱軸），這樣分析物就發生了擴散（圖5擴散），當進樣體積加大，進入色譜系統的溶劑會改變色譜柱的流動相組成，甚至會頂替掉流動相（圖5溶劑替代），在溶劑的洗脫下，出峰時間就會提早，溶劑里的分析物F和在色譜過程開始的與固定相結合的分析物F會先后流出，這樣就形成了分叉峰（圖5檢測）。
圖5.溶劑造成的峰擴散和峰分叉過程。橘黃色為溶劑，黑色為分析化合物，淡藍色為色譜
三、結論
1. 溶解分析物的溶劑最好使用流動相或者洗脫能力比流動相小的溶劑，避免峰展開。
2. 考慮到分析物溶解性，如果選用洗脫能力比流動相強的溶劑，盡量減小進樣體積，避免對色譜造成大的擾動。
3. 如果目標是能檢測2μg/ml的濃度，而現有分析方法的定量限LOQ是10μg/ml，請慎重使用加大進樣量的改進方法，加大進樣量會產生很多意想不到的問題，結果通常是進樣量加大5倍，LOQ一般不會提高5倍。
（內容來源液相色譜之家）
