分光光度計(jì)是現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)儀器，常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量。
分光光度計(jì)可以有不同的分類(lèi)，最常見(jiàn)的分類(lèi)是按使用波長(zhǎng)范圍劃分分為可見(jiàn)分光光度計(jì)和紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)兩類(lèi)。前者使用的波長(zhǎng)范圍為400～780nm，后者使用的波長(zhǎng)范圍為200～1000nm。
分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光源透過(guò)測(cè)試的樣品后，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
下面主要講解分光光度計(jì)的應(yīng)用。
一、核酸的定量
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長(zhǎng) 260 nm。 每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類(lèi)型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上 述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，而后測(cè)試空白液和樣品液。
另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等，在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。
樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素。由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了最大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過(guò)低，或者過(guò)高(超過(guò)光度計(jì)的測(cè)試范圍)。
最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無(wú)懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
除了核酸濃度，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如 A 260 / A 280 的比值，用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?nbsp;280 nm。純凈的樣品，比值大于1.8(DNA)或者 2.0(RNA)。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類(lèi)物質(zhì)的影響。A 230 表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320 檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320 一般是 0。
二、蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)
這種方法是在280 nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇 Warburg公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。
蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除 320 nm的“背景”信息，設(shè)定此功能“開(kāi)”。與測(cè)試核酸類(lèi)似，要求 A 280 的吸光值至少大于 0.1A，最佳的線性范圍在 1.0-1.5 之間。實(shí)驗(yàn)中選擇 Warburg公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要觀察A 280 的吸光值的變化范圍不超過(guò) 1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。
漂移的原因是因?yàn)?nbsp;Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì)被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。
蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如 DNA 的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
三、細(xì)菌細(xì)胞密度(OD 600)的測(cè)定
實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600 是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。 以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對(duì)每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做出校正曲線。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。另外，需要注意的是，測(cè)試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。
隨著生命科學(xué)以及相關(guān)學(xué)科發(fā)展，對(duì)此類(lèi)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究提出更高的要求，分光光度計(jì)將是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室不可缺少的儀器，也成為微生物、食品、制藥等相關(guān)實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)的必備儀器設(shè)備之一。
