本方法適用于鮮活水產品及其制品中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠的檢驗。
一、方法原理
試樣中殘留的孔雀石綠經乙腈-乙酸鹽酸緩沖混合液提取后，經乙腈再次提取，液液分配到二氯甲烷層并濃縮，經酸性氧化鋁柱凈化后，高效液相色譜—二氧化鉛柱后衍生測定，外標法定量。
二、主要儀器設備
1. 上海儀電分析高效液相色譜儀LC210，帶紫外檢測器
3.超聲波水浴
4.電熱恒溫水浴鍋
5.勻漿機
6.離心機：4 000 r/min。
7.固相萃取裝置
8.25% PbO2氧化柱：臨用前用甲醇沖洗，并將PbO2氧化柱連接在紫外-可見檢測器
液相色譜柱之間
9.酸性氧化鋁柱：1g/3mL，使用前用5 mL乙腈活化
三、試劑
1.乙腈：色譜純
2. 二氯甲烷：分析純
3. 甲醇：色譜純
4. 乙酸鹽緩沖液：準確稱取4.95g 無水乙酸鈉及0.95g對-甲苯磺酸，溶解于950mL水中，用冰乙酸調節溶液pH至4.5， 最后用水稀釋到1L。
5. 20%鹽酸羥胺溶液。
6. 對-甲苯磺酸溶液1.0 mol/L：準確稱取17.2g對-甲苯磺酸，置于100mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，混勻。
7.乙酸銨緩沖溶液50 mmol/L：準確稱取3.85g無水乙酸銨，置于1000mL容量瓶中，用冰乙酸調pH到4.5。
8.孔雀石綠標準溶液：準確稱取適量的孔雀石綠，用乙腈配制成100μg/mL的標準貯備液。準確吸取1mL 100μg/mL的標準儲備液于100mL棕色容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，混勻，該標準溶液濃度為1μg/mL，于-18℃避光保存。
9.孔雀石綠標準工作液：準確吸取0.5mL 1μg/mL孔雀石綠標準溶液于25mL棕色容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，混勻，此標準工作液濃度為20ng/mL，于-18℃避光保存。
四、操作步驟
1、樣品制備
1.1提取
準確稱取5.00 g樣品于50 mL離心管內，加入1.5 mL 20%的鹽酸羥胺溶液、2.5 mL 1.0 mol/L的對-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸鹽緩沖溶液，用勻漿機以10 000 r/min的速度均質30秒，再加入10 mL乙腈劇烈震搖30 秒。加入5g酸性氧化鋁，再次震蕩30 秒。以 3 000 r/min離心10 min。將上層清液轉移至裝有10 mL 水和2 mL 二甘醇的100 mL離心管中，并加入10 mL乙腈，重復上述操作，合并乙腈層。
1.2凈化
在離心管中加入15 mL 二氯甲烷,振蕩10 秒，3 000 r/min離心10 min， 將二氯甲烷層轉移至100 mL的梨形瓶中，再用5 mL乙腈、10 mL 二氯甲烷重復上述操作一次，合并二氯甲烷層，收集于100 mL梨形瓶中。45℃旋轉蒸發至約1 mL，用2.5 mL乙腈溶解殘渣。
將酸性氧化鋁柱安裝在固相萃取裝置上，將梨形瓶中的溶液轉移到固相萃取柱上，再用乙腈洗滌瓶兩次，每次2.5 mL，將洗滌液依次通過酸性氧化鋁柱，控制流速不超過0.6mL/min，收集全部流出液，45℃旋轉蒸發至近干，準確加入0.5 mL乙腈溶解，過0.45μm 濾膜，濾液供液相色譜測定
2、高效液相色譜儀參考條件
色譜柱：C18 4.6 mm(i.d)×250mm，在C18色譜柱和檢測器之間連接二氧化鉛氧化柱；
流動相：乙腈+乙酸銨緩沖溶液(60+40)
流速：1 mL/min；
柱溫：室溫
波長：618 nm；
測定：取相同體積試樣制備液和標準使用液分別注入高效液相色譜儀，根據保留時間按定性，外標峰面積法定量。
3、結果計算
試樣中孔雀石綠的殘留量按下式進行計算，計算結果需扣除空白值。
X=（C*A*V）/(W*As )
式中：
X——樣品中孔雀石綠的殘留量，單位為mg/kg；
C——孔雀石綠標準工作液的濃度，單位為ug/mL；
A——樣品中孔雀石綠的峰面積；
As——孔雀石綠標準工作液的峰面積；
V——樣液最終定容體積，單位為毫升mL
W——最終樣液所代表的試樣量，單位為g；
本方法孔雀石綠的殘留量測定結果系指孔雀石綠和它的代謝物隱色孔雀石綠殘留量的之和，以孔雀石綠表示
4、備注：
參考色譜圖：
10ng/mL孔雀石綠標準溶液
保留時間 | 名稱 | 峰面積 | 峰高 | 半高峰寬 | 理論塔板數 |
5.276 | 孔雀石綠 | 918 | 110 | 7.836 | 9326 |
20ng/mL孔雀石綠標準溶液
保留時間 | 名稱 | 峰面積 | 峰高 | 半高峰寬 | 理論塔板數 |
5.287 | 孔雀石綠 | 1866 | 208 | 8.423 | 8110 |
